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        關(guān)于免疫熒光染色和注意事項介紹
        更新時間:2016-11-26 點(diǎn)擊次數(shù):3241次
          
          
          免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。
          
          免疫熒光染色
          
          (1)冰凍切片用0.01moULPBST(或PBS)漂洗或沖洗3次,每次5min。
          
          (2)3%H2O2孵育10min,再用0.01mol/LPBS沖洗3次,每次5min。
          
          (3)5%一8%的正常動物血清(山羊或馬血清)孵育30-60min。
          
          (4)洗掉血清,滴加一抗(0.01mol/LPBS配制),4℃過夜。
          
          (5)吸出一抗,0.01mol/LPBS沖洗3次,每次5min,加入熒光標(biāo)記的二抗(0.01mol/LPBS配制),4℃過夜。
          
          (6)吸出二抗,0.01mol/LPBS沖洗3次,每次10min。
          
          (7)封片劑封片,熒光顯微鏡觀察照相。典型的實(shí)驗結(jié)果見圖20.2B。
          
          注意事項:
          
          (1)由于熒光容易淬滅,一般僅能維持幾個小時,因此,熒光二抗應(yīng)避光保存,即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應(yīng)盡早照相,目前有市售的熒光增強(qiáng)劑,可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。
          
          (2)常用的熒光素有以下幾種,綠色熒光:FITC、AlexaFluor488和GFP;紅色熒光:TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed;藍(lán)色熒光:Hoechst、DAPI;黃色熒光:YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
          
          (3)不同的熒光素激發(fā)的波長不同,因此,選用濾光片時要注意。一般紫外線的激發(fā)波長為334-365nm,藍(lán)光的激發(fā)波長為435-490nm,綠光的激發(fā)波長為546nm左右。
          
          (4)熒光顯微鏡應(yīng)提前至少15min打開汞燈預(yù)熱。關(guān)閉30min后方可再開啟。
          
          (5)免疫熒光的組織要求很高,載玻片及蓋玻片要干凈無雜質(zhì)。進(jìn)行熒光染色時,需注意染液的pH、濃度和染色溫度,還要避免對熒光有熄滅作用的物質(zhì)的接觸。組織和細(xì)胞也有自發(fā)熒光,如紅細(xì)胞中的血紅蛋白呈紅色熒光,維生素A呈綠色自發(fā)性熒光等。
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