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        流式細胞技術實驗方法
        更新時間:2017-05-02 點擊次數:3360次

        流式細胞技術實驗方法

        PI 染色操作步驟

        1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

        2、加入PBS 1ml離心洗滌1次,棄上清。

        3、加入2ml預冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定過夜。

        4、離心,棄上清液。

        5、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

        6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,離心。

        7、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

        8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室溫避光孵育30min。

        9、混勻,過300目篩網,置流式管中, 4℃冰箱保存,待測。

        GFP PI染色操作步驟

        1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

        2、加入PBS 1ml離心洗滌1次,棄上清。

        3、加入2ml預冷PFA,PFA的濃度根據細胞的特點進行調節,4℃固定30min。 以下步驟同PI 染色操作步驟的(4-9)

        細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

        1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

        2、以冷PBA 1ml,離心洗滌,棄上清液。

        3、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min-1h。

        4、離心棄上清液。

        5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,以除去未結合的多余抗體成分。

        6、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,置流式管中,4℃避光保存,待測。

        細胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

        1-2、同細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

        3、 用PBA稀釋的*抗體200ul,對照管加入對應于一抗的正常實驗動物IgG,輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心,棄上清。

        4、 PBS 1ml離心洗滌1次,以去除多余的未結合的特異性抗體。

        5、 PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200ul。吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min,避光。

        6、 PBS 1ml離心洗滌2次。

        7、將細胞重新懸浮于500ulPBS中,混勻,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待測。


        胞內直接免疫熒光染色操作步驟

        1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500 rpm , 5 min,棄上清液。

        2、用1×PBS 1 ml洗滌1次,離心。

        3、4% PFA 1ml,4 ℃固定30min。

        4、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

        5、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min。

        6、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

        7、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul,用微量移液器輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育30 min-1h。

        8、離心棄上清液。

        9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,以除去未結合的多余抗體成分。

        10、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,置流式管中,4℃避光保存,待測。

        胞內間接免疫熒光染色操作步驟

        1-6、同胞內直接免疫熒光染色操作步驟

        7、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul,對照管加入對應于一抗的正常實驗動物IgG,輕輕吹打混勻,4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h。離心,棄上清。

        8、冷PBS 1ml離心洗滌1次,以去除多余的未結合的特異性抗體。

        9、加入PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200 ul。吹打混勻,4 ℃或置冰上孵育30 min,避光。

        10、冷PBA 1ml離心洗滌2次。

        11、將細胞重新懸浮于500 ul PBS中,混勻,置流式管中,避光,4 ℃冰箱保存,待測。
        備注:

        1、 RNase A: 貯液濃度:1mg/ml ;

        工作液配制:加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 20ug/ml。

        2、PI: 貯液濃度:2.5mg/ml;

        工作液配制: 加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 50ug/ml。

        3、PBA : 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,加0.1%疊氮鈉。

        4、檢測樣品細胞濃度1x10 /ml。

         

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