實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是在PCR進(jìn)行的同時，對其過程進(jìn)行監(jiān)測的能力（即實(shí)時）。因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過程中，而非PCR結(jié)束之后，進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在熒光定量PCR(qPCR)中，反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴(kuò)增的時間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點(diǎn)法檢測（也稱“讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。

　　

　　熒光定量PCR將PCR擴(kuò)增和檢測合并為單一步驟。這樣就無需使用凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測，更重要的是這一方法是真正定量的。在熒光定量PCR中，熒光染料被用來在熱循環(huán)中標(biāo)記PCR產(chǎn)物。熒光定量PCR儀器在反應(yīng)的對數(shù)期測定熒光信號的積累，獲得快速的PCR產(chǎn)物定量以及客觀的數(shù)據(jù)分析。

　　

　　熒光定量PCR分析常見術(shù)語：

　　

　　擴(kuò)增子：PCR過程而產(chǎn)生的DNA短片段

　　

　　擴(kuò)增曲線：根據(jù)熒光信號相對于循環(huán)數(shù)而制作的曲線

　　

　　基線：PCR起始時，熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)

　　

　　Ct（閾值循環(huán)）：熒光信號超過NTC（無模板對照樣品）固定閾值時的循環(huán)數(shù)。用于對擴(kuò)增質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。

　　

　　核酸目標(biāo)：（也稱為“目標(biāo)模板”）——需要擴(kuò)增的DNA或RNA序列

　　

　　惰性參比染料：一種可作為內(nèi)部對照，以用于在數(shù)據(jù)分析時對報(bào)告基團(tuán)染料信號進(jìn)行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動進(jìn)行的必要校正。所有的SDSPCR試劑盒都提供了參比熒光對照。

　　

　　Rn（均一化報(bào)告基團(tuán)）：報(bào)告基團(tuán)染料釋放的熒光強(qiáng)度除以惰性參比染料釋放的熒光強(qiáng)度

　　

　　Rn+：一次反應(yīng)的Rn值包含所有的組分，包括模板

　　

　　Rn-：未反應(yīng)樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲取：

　　

　　實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)運(yùn)行的早期循環(huán)（產(chǎn)生可被檢測的熒光信號之前的循環(huán)），或不含有任何模板的反應(yīng)。

　　

　　ΔRn(deltaRn)：在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號量級。

　　

　　ΔRn可通過以下公式計(jì)算：(Rn+)–(Rn-)標(biāo)準(zhǔn)品具有已知濃度的A樣本，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，您可構(gòu)建用于未知樣品定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　

　　閾值：早期PCR循環(huán)時Rn值的平均標(biāo)準(zhǔn)差，乘以相應(yīng)的校正系數(shù)閾值應(yīng)當(dāng)設(shè)定在PCR指數(shù)擴(kuò)增時的相關(guān)區(qū)域。

　　

　　未知：具有未知模板量的樣品。即，您需要進(jìn)行檢測的樣品。