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        技術(shù)服務(wù)Article

        RIP實(shí)驗(yàn)流程介紹
        更新時(shí)間:2022-03-29 點(diǎn)擊次數(shù):1353次
          RIP技術(shù)主要是運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái),經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測(cè)序分析。RIP是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具,可以幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。根據(jù)需求,金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗(yàn)證RIP技術(shù)服務(wù)。
         
          應(yīng)用:
         
          1.用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白;
         
          2.防止非特異性的RNA的結(jié)合;
         
          3.免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái);
         
          4.結(jié)合的RNA序列通過(guò)定量RT-PCR或高通量測(cè)序(RIP-Seq)方法來(lái)鑒定。
         
          RIP實(shí)驗(yàn)流程:
         
          (一)細(xì)胞裂解液獲取
         
          A.單層細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞處理
         
          1.冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞兩次
         
          2.加入冷PBS后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來(lái),收集至enpendoff管
         
          3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細(xì)胞
         
          4.用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞,吹打均勻后于冰上靜置5min
         
          5.每管分裝200ul細(xì)胞裂解液,貯存于-80℃
         
          B.懸浮細(xì)胞處理:先收集細(xì)胞再計(jì)數(shù),然后清洗裂解
         
          C.組織樣品處理
         
          1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
         
          2.加入冷PBS后,用勻漿器或其他細(xì)胞分離設(shè)備使組織分散為單個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)
         
          3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細(xì)胞
         
          4.用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞,吹打均勻后置于冰上靜置5min
         
          5.每管分裝200ul細(xì)胞裂解液,貯存于-80℃
         
          (二)磁珠的準(zhǔn)備
         
          A.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
         
          1、enpendoff管
         
          2、磁力架
         
          3、冰盒,RIPWashBuffer置于冰上
         
          4、抗體,置于冰上
         
          5、渦旋震蕩器
         
          6、槍、槍頭放于超凈臺(tái)照射30min,槍噴DEPC水
         
          B.磁珠準(zhǔn)備過(guò)程
         
          1.重懸磁珠
         
          2.標(biāo)記實(shí)驗(yàn)所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照
         
          3.吸取50ul重懸后的磁珠懸液于每個(gè)enpendoff管
         
          4.每管加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩
         
          5.將enpendoff管置于磁力架上,并左右轉(zhuǎn)動(dòng)15°使磁珠吸附成一條直線,去上清,重復(fù)一次
         
          6.用100ul的RIPWashBuffer重懸磁珠,加入約5ug相應(yīng)抗體于每個(gè)樣品中
         
          7.室溫孵育30min
         
          8.將enpendoff管置于磁力架上,棄上清
         
          9.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩后棄上清,重復(fù)一次
         
          10.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩后置于冰上
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