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        時(shí)間分辨熒光免疫分析

        更新時(shí)間:2014-07-23 點(diǎn)擊次數(shù):2353次
        時(shí)間分辨熒光免疫測定(TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術(shù),它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體,根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn),用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光,同時(shí)檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號分辨,可有效地排除非特異熒光的干擾,極大地提高了分析靈敏度。
         
         
        分析原理
         
        在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光,因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測的靈敏度就會嚴(yán)重下降。大部分背景熒光信號是短時(shí)存在的,因此將長衰減壽命的標(biāo)記物與時(shí)間分辨熒光技術(shù)相結(jié)合,就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到zui小化。
         
        時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)實(shí)際上是在熒光分析(FIA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響,同時(shí),熒光分析與普通分光不同,光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上,激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器,從而大幅度地提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是,當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候,激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此,解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。
         
        解決雜散光影響的方法當(dāng)然是測量時(shí)沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短,激發(fā)光消失,熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長,可達(dá)1~2ms,能夠滿足測量要求,因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法,即使用長效熒光標(biāo)記物,在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強(qiáng)度的分析方法。
        平時(shí)常用的稀土金屬主要是Eu(銪)和Tb(鋱),Eu熒光壽命1ms,在水中不穩(wěn)定,但加入增強(qiáng)劑后可以克服;Tb熒光壽命1.6ms,水中穩(wěn)定,但其熒光波長短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解,因此從測量方法學(xué)上看Tb很好,但不適合用于生物分析,故Euzui為常用。
         
        信號原理
         
        普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,在選擇熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí),必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的波長差,即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊,相互干擾,影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移,zui大可達(dá)290nm,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜間不會相互重疊,加上其發(fā)射的光譜信號峰很窄,熒光壽命長,銪的熒光壽命可達(dá)730us,檢測中只要在每個(gè)激發(fā)光脈沖過后采用延緩測量時(shí)間的方式,待短壽命的背景熒光衰變消失后,再打開取樣門儀器記錄長壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光,可以避免本底熒光干擾,提高檢測的精密度。
         
        TRFIA的測量儀器是時(shí)間分辨熒光計(jì),由三大部分組成:光源:脈沖光源:氙燈(每秒閃爍1000次);小型N2激光器;輸出脈沖波長:337nm熒光信號獲取系統(tǒng);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。
         
        增強(qiáng)原理
         
        解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―ELFIA)是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑,使其一端與銪(Eu)連接,另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接,形成EU標(biāo)記的抗體/抗原,經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱,因此加入一種增強(qiáng)劑,使Eu從復(fù)合物上解離下來,自由Eu同增強(qiáng)劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán),這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光,信號增強(qiáng)了百萬倍。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟,因此稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥_@是目前在時(shí)間分辨熒光免疫分析中應(yīng)用zui多的一種分析系統(tǒng)。

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